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柱后衍生设备检测方案书

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柱后衍生设备检测方案书

规格：TW-PCD2000

所属类型：仪器仪表

价格：128000元(含税)
发布时间：2016/4/8 10:27:08
数量：1台
所在地：湖北武汉

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产品信息

产品介绍

柱后衍生设备检测方案书

柱后衍生设备检测方案书
色谱是一种分离科学,HPLC象其他类的色谱一样,依据样品的结构进行分离,HPLC分很多种,它们往往可以将物质分离,被分离的组分峰应该被检测到,通常常用的检测器为UV/VIS或荧光检测器,但是很多物质不能够被检测,或者很难与背景区分以致不能被检测。柱后衍生则很好地解决了这一问题。
柱后衍生也称为柱后反应,主要目的是使本来不可检测的物质变为可检测的物质,这种方法主要是将分离后的物质通过反应使之具有可检测的物理性质。典型的方法是通过一种反应使物质带有带色基团,或使物质能够产生荧光。在有些情况下可以使检测灵敏度提高几个数量级。大部分的溶剂对于某一特定类型的物质有一定的选择性,该类物质因而可以从复杂的背景中被检测到。所以柱后衍生的大作用在于提高灵敏度和选择性。
柱后衍生系统是将HPLC的柱后洗提液与衍生试剂混合,混合溶液在一定的时间内通过反应器完成反应,如果反应速度慢,将加热反应器以提高反应速度。有些反应则需要加入两种溶剂, 后混合液进入检测器检测一般是用UV/VIS或荧光检测。一个完善的柱后衍生系统需要计量泵、脉冲阻尼器、加热线圈、安全系统等以确保提供安全、可靠的数据。
柱后衍生系统和方法为您提供的可选择性、灵敏性和色谱重现性是UV-VIS 或柱前衍生方法所不能及的。柱后衍生仪可以与一套标准的液相色谱相连,配备衍生试剂和柱后设备为您提供一套可靠、的分离与检测方法。能为下列各种物质的分离与检测提供从仪器、试剂到分析方法的全套解决方案。
一、氨基酸
二、氨基甲酸酯
三、草甘膦

氨基酸
介绍
柱后衍生技术可以改善灵敏度,提高选择性(减少干扰),降低检测限。柱后衍生使用离子交换钠柱来测定蛋白质水解产物中的氨基酸,使用离子交换锂柱检测天然产物中的氨基酸。氨基酸柱后衍生的检测有两种手段。可以使用茚三酮试剂,来检测一级和二级氨基酸,或者使用邻苯二甲醛(OPA),荧光检测,检测灵敏度更高,但只能分析一级氨基酸。

完全的柱后衍生系统包括如下部件:
? HPLC 梯度泵
? 带高pH 相容性的Tefzel 或者PEEK 密封的手动进样器或者自动进样器
? 离子交换柱
? 柱后衍生仪器
? 洗提液,试剂和标准物
? 可见或荧光检测器
? 图谱记录,积分和数据系统

背景
分离包括多种机制:离子交换、离子排阻、分配。主要过程为阳离子交换,pH 梯度将氨基酸调整至等电点。酸性氨基酸例如:谷氨酸,出峰时间早;碱性氨基酸例如:赖氨酸,出峰时间晚。分配机制受离子强度与有机修饰剂的影响。例如:苏氨酸和丝氨酸的分离依靠分配基质。离子排阻作用发生在强酸性氨基酸,例如:牛磺酸。
使用阳离子交换色谱柱可以快速分析水解蛋白质或者组成简单产品中的22 种氨基酸。锂离子交换柱分析时间长、但可以得到更高的分离度,可以分离复杂生物体液和组织提取物中的46 种氨基酸和化合物。
柱后衍生常用的检测试剂为茚三酮。茚三酮与一级氨基酸反应,生成的还原茚三酮形成Ruhemann’s 紫色的荧光(如下图),可在570nm 被检测出。茚三酮与二级氨基酸反应生成黄色复合物,可在440nm 出被检测。茚三酮的反应可在130℃,容量为500μL 的反应器中进行。需要提高反应温度,因为在常温下茚三酮的反应很慢。

另一种试剂系统为邻苯二甲醛(OPA),分析一级氨基酸时产生具有很高的检测灵敏度。在碱性条件下,OPA快速与一级氨基酸和亲核试剂Thiofluor (N,N-二甲基-2 巯乙胺)反应产生带荧光的异吲哚衍生物(如下图)。OPA 不与二级氨基酸和芳胺反应,所以不能检测脯氨酸和其它二级氨基酸。

然而,也有可能先将物质氧化,然后再与OPA 试剂反应,这一技术既有许多缺点,如详细了解请联系武汉恒新世纪科技有限公司。
用于茚三酮法的仪器配置与使用OPA 法基本一致,除了OPA 法反应器的体积为150μL,反应温度为40℃。

基本样品制备
生理液体和蛋白质水解样品的一般制备过程。许多中样品会需要做氨基酸分析。

血浆、尿液、其它生理体液、植物提取物、食物和饮料中的天然氨基酸以“游离”状态存在,对这些样品的制备比水解氨基酸简单,省时。但是调节pH 和浓度,除去可溶氨基酸的过程会色谱图有很大影响。

早出峰的氨基酸-牛磺酸,尿素,苏氨酸,丝氨酸等-对pH 和浓度特别敏感,通常样品的pH 范围必须控制在2.1 和2.5 这一狭小的范围之间,和适当的锂离子浓度来保证重复性。后出峰物质对初始条件更耐受。SERAPREPTM 和URIPREPTM 替代常规使用的蛋白质沉淀剂,例如:乙晴、高氯酸、苦味酸。不用透析、超滤、多重离心。

? 所有样品均用0.45μm 过滤膜过滤,有些样品则可能需要用更细的过滤膜,尤其存在胶体时。
? 样品必须缓冲,进样的理想pH 范围为2.2±0.2。
? 对于天然样品,分析前将所有的蛋白质去掉。

生理体液样品
使用制备SERAPREP 和URIPREP
使用SERAPREP提供高缓冲容量,制备血浆和其它样品。例如:沙丁鱼油。使用URIPREP
提供低缓冲容量制备尿液和其它样品,例如:果汁,瘤。蛋白质沉淀的效率和离心后pH 调整的需要决定了哪种更适合你的样品。
1. 在微离心管中完全混合等量的样品和SERAPREPTM 或者URIPREPTM
2. 静止5 分钟,将混合物以13000rpm 的转速离心5 分钟。
检查上清液pH 值确定pH 范围在2.3±0.2,根据需要调整初混合比例。
3. 用注射过滤器(0.2 或者0.45μm)过滤上清液,过滤液可放入自动进样瓶进行氨基酸分析。
4. 如果需要进一步稀释,使用Li 220 调整分析物浓度。
试剂准备
1 将945mL OPA 稀释剂(Cat No OD104)倒入试剂瓶,留5mL 第五步使用。
2 盖上瓶盖,打开进气阀,开启气源。使惰性气体喷射满全瓶。持续冒泡10 分钟
3 将300mgOPA(Cat NO O120)溶解于10mL 色谱柱甲醇中。
4 关闭气源,打开瓶盖。将OPA 溶液倒入已经去氧的稀释液中。用1-2mL 的甲醇冲洗残留在瓶中的混合物。
5 溶解2g ThiofluorTM(Cat NO 3700-2000)与步留下的5mLOPA 稀释液中并倒入试剂瓶。
6 加入3mL 35%的Brij-35 溶液
7 盖上瓶盖,打开气源,使其喷射几分钟后关闭进气阀。轻轻摇动试剂瓶使其完全混匀。
注意:OPA 试剂对氧敏感,并逐渐降解。Pinnacle PCX 系统减慢它的氧化,OPA 试剂子在惰性气体的压力
下,一周内活性不会明显降低。

柱后衍生条件
这里推荐常使用的氨基酸分析的柱后条件。HPLC 的条件,参看各段的开头样品色谱与梯度程序。
使用OPA 试剂
试剂1:邻苯二甲醛和ThiofluorTM 于OD104 稀释液中,再加35%Brij-35®
泵1 流速:0.30ml/min
反应器1 体积:500μL
反应器温度:45℃
使用次氯酸钠,然后再用OPA 试剂
试剂1:次氯酸钠于GA116 稀释剂中
试剂2:邻苯二甲醛和ThiofluorTM 于OD104 稀释剂,加35%Brij-35®。
泵1 流速:0.30ml/min 泵2 流速:0.30ml/min
反应器1 体积:500μL 反应器2 体积:100μL
反应器1 温度:45℃ 反应器2 温度:室温

过程
根据色谱柱类型和样品的不同, 推荐6 种不同的梯度条件。
柱温箱的控温程序为方法的优化提高了便利,使用温度梯度可以改善分离,缩短分离时间,调整检测方法。为了保护色谱柱将HPLC 的大压力设置为220bar,在初始条件下平衡30 分钟。进10μL 氨基酸标样,至少收集三张谱图。张谱图放弃不用,使用后两张评估系统。

分析和柱后衍生条件
方法1:生理体液分析,高效锂柱
保护柱:0352020 柱温:38℃ HPLC 流速:0.35ml/min

峰归属

1 磷酸丝氨酸 16 丙氨酸 31 γ-氨基丁酸
2 牛磺酸 17 瓜氨酸 32 色氨酸
3 磷酸乙醇胺 18 α-氨基-n-丁酸 33 2-氨基乙醇
4 尿素 19 缬氨酸 34 羟(基)赖氨酸
5 门冬氨酸 20 胱氨酸 35 氨
6 羟基脯氨酸 21 甲硫氨酸 36 肌酸肝
7 苏氨酸 22 胱硫醚 37 鸟氨酸
8 丝氨酸 23 异亮氨酸 38 赖氨酸
9 天(门)冬氨酰苯丙氨酸甲酯 24 亮氨酸 39 组氨酸
10 谷氨酸 25 正亮氨酸 40 3-甲基组氨酸
11 谷氨酸盐 26 酪氨酸 41 1-甲基组氨酸
12 肌氨酸 27 苯基丙氨酸 42 肌肽
13 α-脂肪酸胺 28 丙氨酸 43 鹅肌肽
14 脯氨酸 29 α-氨基-i-丁酸 44 α-氨基-β-胍基丙酸
15 甘氨酸 30 高胱氨酸 45 精氨酸

方法2:使用梯度升温程序分析生理样品,高效锂柱(0354100A)
保护柱:0352020 HPLC 流速:0.4mL/min 初始温度:32℃

柱温程序
时间(min) 温度℃
0 32
13 32
30 61
67 61
80 70
90 70
92 32

方法3:生理体液分析,标准锂柱(0393250)
保护柱: 柱温:40℃ HPLC 流速:0.30ml/min

方法4:苯丙酮尿病(PKU)与槭糖尿病(MSUD)的快速检测,高效锂柱

保护柱:0352020 HPLC 流速:0.35mL/min 柱温:38℃
步骤时间(分钟) 间隔 %Li280 %Li750 %RG003 备注
0 0 0 86 14 0 进样
1 25 11 73 27 0 线性梯度
2 25.1 0.1 0 0 100 阶跃梯度
3 30 16.9 0 0 100 等度
4 30.1 0.1 86 14 0 阶跃梯度
5 42 14.9 86 14 0 重新平衡

方法5:苯丙酮尿病(PKU)与槭糖尿病(MSUD)的检测,高效锂柱(0354050)
保护柱:0352020 柱温:65℃ HPLC 流速:0.40mL/min
步骤时间(分钟) 间隔 %Li375 %RG003 备注
0 0 0 100 0 进样
1 8 8 100 0 等度
2 8.1 0.1 0 100 阶跃梯度
3 10 1.9 0 100 等度
4 10.1 0.1 100 0 阶跃梯度
5 16 5.9 100 0 重新平衡

方法6:胶原和蛋白质水解产物分析,高效钠柱
保护柱: 柱温:48℃ HPLC 流速:0.40mL/min
步骤时间(分钟) 间隔 %1700-0112 %Na740 %RG011 备注
0 0 0 100 0 0 进样
1 12 12 100 0 0 等度
2 34 22 0 100 0 阶跃梯度
3 53 19 0 100 0 等度
4 53.1 0.1 0 0 100 阶跃梯度
5 55 1.9 0 0 100 等度
6 55.1 0.1 100 0 0 等度
7 67 11.9 100 0 0 重新平衡
胶原蛋白水解产物

1 蛋氨酸亚砜 8 甘氨酸 15 酪氨酸 22 精氨酸
2 羟脯氨酸 9 丙氨酸 16 苯丙氨酸 23 磺丙氨酸
3 门冬氨酸 10 胱氨酸 17 羟赖氨酸 24 蛋氨酸砜
4 苏氨酸 11 缬氨酸 18 赖氨酸 25 正亮氨酸
5 丝氨酸 12 蛋氨酸 19 氨
6 谷氨酸 13 异亮氨酸 20 组氨酸
7 脯氨酸 14 亮氨酸 21 色氨酸
方法七:梯度升温程序分析胶原和蛋白质水解产物,高效钠柱
保护柱: 柱温:46℃ HPLC 流速:0.40mL/min

步骤时间(分钟) 间隔 %1700-0112 %Na740 %RG011 备注
0 0 0 100 0 0 进样
1 11 11 100 0 0 等度
2 25 14 30 70 0 线性梯度
3 25.1 0.1 0 100 0 阶跃梯度
4 42 16.9 0 100 0 等度
5 42.1 0.1 0 0 100 阶跃梯度
6 45 29 0 0 100 等度
7 45.1 0.1 100 0 0 阶跃梯度
8 60 14.9 100 0 0 重新平衡

色谱柱升温程序
时间(min) 温度(℃)
0 46
5 46
20 55
40 70
42 46

方法八:梯度升温程序分析氧化饲料中硫化氨基酸,高效钠柱(1154150)
保护柱:1193020 柱温:50℃ HPLC 流速:0.40mL/min
步骤时间(分钟) 间隔 %Na270 %Na740 %RG011 备注
0 0 0 100 0 0 进样
1 12 12 100 0 0 等度
2 28 16 50 50 0 线性梯度
3 28.1 0.1 0 100 0 阶跃梯度
4 46 17.9 0 100 0 等度
5 46.1 0.1 0 0 100 阶跃梯度
6 49 2.9 0 0 100 等度
7 49.1 0.1 100 0 0 阶跃梯度
8 64 14.9 100 0 0 重新平衡

色谱柱升温程序
时间(min) 温度(℃)
0 50
14 50
30 70
44 70
46 50

方法九:蛋白质水解物,标准钠柱(1193250)

保护柱:1192020 柱温:48℃ HPLC 流速:0.30mL/min
步骤时间(分钟) 间隔 %Na328 %Na740 %RG011 备注
0 0 0 100 0 0 进样
1 10 10 100 0 0 等度
2 32 22 0 100 0 线性梯度
3 56 24 0 100 0 等度
4 56.1 0.1 0 0 100 阶跃梯度
5 58 1.9 0 0 100 等度
6 58.1 0.1 100 0 0 阶跃梯度
7 70 0.1 100 0 0 重新平衡

方法十:分析氧化饲料中硫化氨基酸,标准钠柱(1193250)

保护柱:1193020 柱温:55℃ HPLC 流速:0.40mL/min

步骤时间(分钟) 间隔 %Na270 %Na740 %RG011 备注
0 0 0 100 0 0 进样
1 14 14 100 0 0 等度
2 42 28 0 100 0 线性梯度
3 56 14 0 100 0 等度
4 56.1 0.1 0 0 100 阶跃梯度
5 58 1.9 0 0 100 等度
6 58.1 0.1 100 0 0 阶跃梯度
7 70 11.9 100 0 0 重新平衡

注意事项
避免皮肤直接接触试剂瓶和吸管,指纹上的氨基酸会造成污染,建议带手套。

当离子交换色谱柱和反相色谱柱转换时,在连接色谱柱时一定要用去离子水清洗HPLC 和进样阀。可能一种应用使用的洗提液会影响另外一种的色谱柱或其它配件。

使用柱前过滤器或者保护柱来保护分析柱
因为洗提液有腐蚀性,建议平时使用时检查色谱柱接头是否泄漏。

不要在压力超过2800psi(193bar)的状态下过长时间使用色谱柱。背压高时及时更换可能导致高压的保护柱、分析柱、或者0.5μm线过滤器。

注意:过滤器和保护柱的压力应<36bars
关闭前用再生液冲洗色谱柱15-20 分钟,将色谱柱中储存在再生液中。
拆色谱柱时,用水冲洗接头末端,然后堵上塞,防止腐蚀。
污染首先会发生在保护柱,将它们分别冲洗,节省时间。
小心离子污染:铁离子和其它多价阳离子、有机染料、油脂、表面活性剂和清洁剂。它们可能导致不可逆的损坏。
有机溶剂会使色谱柱中树脂的膨胀,产生高背压和峰形展宽。这种情况下,色谱柱有时可能可以再生。
试剂制备过程中必须佩戴手套,OPA 和ThiofluorTM 会皮肤有刺激性。指印会导致试剂污染,TRIONE®会使皮肤染色。
OPA 试剂遇空气易氧化,降解。在加压试剂瓶中一周内性质稳定。
ThiofluorTM 为强亲核试剂,在密闭容器中保存。
不推荐用户自制OPA 稀释剂,因为硼酸钠(任何等级)包含着大量的重金属离子污染物和不溶物质。这些不纯物会沉淀在反应器和流通池中。由此造成的损坏不在保修范围之中。
预先混合的TRIONE®的保存期限为3 个月,期间生成沉淀物的可能性增加。使用过期的TRIONE®会导致柱后衍生系统堵塞。
随着放置时间的延长TRIONE®对一级氨基酸的颜色强度增加20%。所以当更换TRIONE®批号时会使灵敏度小幅度降低。
氧化了的TRIONE®对一级氨基酸的颜色强度下降,但是不影响对二级氨基酸的强度。试剂在氧化的过程中变的越来越黄。
经常观察和记录压力,检查泄漏,及时发现问题。
除非背压调节器连接于检测器的废液管上,不要当洗提液的压力超过沸点时操作加热反应器。反应器内的沸腾会产生沉淀堵塞反应器,由此造成的损坏不在保修范围之中。
注意:在改变梯度、温度和其它操作条件之前,至少运行两次确认问题。改变之后,至少运行两次,出现相同结果后确认。特别是在优化梯度条件时。
一次只改变一个参数
至少运行两次,出现相同结果后再改变参数。所以至少进样三次,因为次进样往往不具有代表性。首先优化开始的梯度条件。
每个HPLC 模式的梯度条件均不同,本手册中推荐的程序为常用的HPLC 泵程序。如果只需要色谱图的前端,可以省去后面的梯度程序,使用再生溶液直到碱性强的精氨酸洗脱出来,然后用初的缓冲溶液重新平衡。
分离效果对温度敏感,调整温度会改善分离。例如,当色谱柱温度降低时,苏氨酸和丝氨酸的分离度得到改善。但是温度略微升高时,酪氨酸和苯基丙氨酸分离度得到改善。
表面活性剂、染料、茚三酮和脂肪通常不能去除,只能防止。

氨基甲酸酯

介绍
农残检测方法主要有液相色谱法、光谱法、气质联用等,其中柱后衍生的高效液相法方法简单、可靠、灵敏度高。武汉恒信“CO”系列衍生系统引进国外先进的温度控制技术和关键的控制元器件,各项性能均能达到国外同类型仪器的指标,完全可以满足农业部相关标准的要求。且性能价格比远优于进口产品。

温控器面板示意图

柱后衍生原理

背景
氨基甲酸酯类农药由于高效、经济而被广泛应用于蔬菜水果种植过程,但会对生态环境造成严重污染,并引发中毒。2004 年发布的我国农业标准NY/T 761 中,柱分离后在线水解生成的甲胺进行荧光衍生的检测方法作为蔬菜和水果中氨基甲酸酯类农药多残留检测方法被采纳。

N-氨基甲酸酯类化合物经反相色谱法分离,柱后在碱的条件下水分解生成甲胺。生成的甲胺与一级胺的荧光衍生化试剂O-苯二甲醛(OPA)反应,进行较高灵敏度的荧光检测。

氨基甲酸酯的一般结构是N-甲基取代氨基甲酸酯,有不同的成酯基团。结构分子式如图

图中的10 种氨基甲酸酯的分离可用 5μm C18 柱温恒定、以水/甲醇梯度洗脱。其出峰顺序根据其相对的疏水性。氨基甲酸酯(methiocarb)疏水性强, 后被洗脱出来。

分析过程:氨基甲酸酯首先被NaOH溶液在100℃水解形成醇、碳酸盐、和甲胺。第二次反应中甲胺与邻苯二甲醛(OPA)和亲和试剂ThiofluorTM试剂反应形成一种高荧光的衍生物。

注意:1-萘酚不需要衍生也有荧光,胺甲萘水解后衍生也生成1-萘酚,但是两者具有不同的保留时间。这一特点可被用于故障诊断。

基本样品制备
下面是对蔬菜和水样品的制备。更多的细节请参看EPA531.2 对饮用水的检测,AOAC 对蔬菜的检测。

对蔬菜样品的检测

用已睛提取氨基甲酸酯
用甲醇重新溶解
用0.45μm 滤膜过滤

对水样品的检测
采样标准
EPA 采用标准
1 加1.8mL ClorAC 缓冲液到60mL 样品瓶(井水和河水见注释)
2 如果样品被氯化,每60ml 样品加入5mg 硫代硫酸钠。
3 将去氯化的样品加入到样品瓶中,密封并混匀。
4 10℃储存,4℃下运输可保存28 天。

样品制备
用0.45μm 滤膜过滤2mL 样品
进样量200-400μL

对标准品和空白:
将10mL ChorAC 用色谱纯水稀释至1000mL

注释:井水和河水中含有胶状铁离子。如果样品未过滤便储存,那么铁离子只有在反应器遇到NaOH 时才又沉淀出来。所以推荐先用0.45μm 滤膜过滤后再用ChlorAC 溶液保存。

试剂制备
氨基甲酸酯的分析需要两中衍生试剂:水解试剂(NaOH)和邻苯二醛

注意:首次使用前必须对试剂瓶、管线和泵进行清洗,再用甲醇冲洗,以较少荧光背景。

试剂1,水解试剂
关掉气源
清洗试剂瓶并用甲醇冲洗,用蘸过甲醇的干净纸巾擦拭吸取管。
水解试剂不需要制备。直接将水解试剂(Cat No CB130)倒入试剂瓶中。盖上瓶盖,关闭进气阀。

水解试剂会一直很温度
注意: 不推荐自己配制水解试剂,因为高纯度的NaOH 很达到。

试剂2:OPA 试剂

1 将945mL OPA 稀释剂(Cat No CB910)倒入试剂瓶,留5mL 第五步使用。
2 盖上瓶盖,打开进气阀,开启气源。使惰性气体喷射满全瓶。持续冒泡10 分钟
3 将100mgOPA(Cat NO O120)溶解于10mL 色谱纯甲醇中。
4 关闭气源,打开瓶盖。将OPA 溶液倒入已经去氧的稀释液中。
5 溶解2g ThiofluorTM(Cat NO 3700-2000)与步留下的5mLOPA 稀释液中并倒入试剂瓶。
6 盖上瓶盖,打开气源,使其喷射几分钟后关闭进气阀。轻轻摇动试剂瓶使其完全混匀。

注意:不推荐自行配制OPA 稀释液,因为硅酸钠包含许多重金属离子和不溶物质。它们将会沉淀在反应器和流通池中。一年的质保不包括此种污染带来的损坏。

OPA 试剂对氧敏感并会降解。当OPA 试剂瓶中充满惰性气体时,OPA 试剂的活性和保持2 周。

柱后分析条件
屏幕显示:4位LED实际温度显示(红色) 4位LED设定温度显示(绿色
氨基甲酸酯分析推荐的柱后衍生条件,相关的HPLC条件参见样品谱图与梯度洗脱部分。

试剂1:CB130,水解试剂(NaOH)
试剂2:邻苯二醛和ThiofluorTM 于CB190 稀释液中
泵1:流速:0.30ml/min
泵2:流速:0.30ml/min
反应器1:500μL100℃
反应器2:100μL 室温

分析过程
在初条件下让色谱柱平衡约20 分钟
注射10μL 氨基甲酸酯测试混合液(或者一定体积的自制标准品),收集张谱图。

样品谱图与梯度洗脱

以下峰名应用与本节的所有谱图
1 涕灭威亚砜 7 残杀威
2 涕灭威砜 8 卡巴呋喃
3 草氨酰 9 胺甲萘
4 甲氨叉威 10 1-萘酚
5 3-羟基卡巴呋喃 11 氨基甲酸酯
6 涕灭威 12 BDMC 内标物

氨基甲酸测试混合物,10μL 进样,25cm,C8 柱(0840250)

氨基甲酸测试混合物,0.25ppb,10μL 进样,25cm,C8 柱(0840250)

0840250 柱(4.0mm ID×250MM)用于甲醇溶解样品
HPLC 流速:0.8ml/min 柱温37℃

氨基甲酸测试混合物,10μL 进样,15cm,C18 柱(1846150)

1846150 柱(4.6mm ID×150MM)用于甲醇溶解样品

HPLC 流速:1ml/min 柱温42℃

氨基甲酸测试混合物,10μL 进样,25cm,C18 柱(1846250)

1846250 柱,(4.6mm ID×250MM)用于甲醇溶解样品

HPLC 流速:1ml/min 柱温42℃

完成分析之后,执行关闭程序,将氨基甲酸酯分析柱保存于甲醇中。

注意:保存OPA 试剂是应保留惰性气体,关闭试剂瓶上蓝色的试剂阀防止不使用时试剂虹吸。

氨基甲酸酯分析的注意事项
配制试剂过程中要始终配带手套,OPA 与ThiofluorTM 试剂会引起皮肤刺激。OPA 试剂为对氧敏感,不断降解。得到佳的灵敏度需新制溶液。在惰性气体的保护下,OPA 试剂可以保存两周。ThiofluorTM 具有强烈的吸湿性,一定要在密封性好的容器中保存。

不推荐用户自制OPA 稀释剂,因为硼酸钠(任何等级)包含着大量的重金属离子污染物和不溶物质。这些不纯物会沉淀在反应器和流通池中。由此造成的损坏不在保修范围之中。

使用色谱级的甲醇和水,防止产生基线漂移、鬼峰和基线噪音。

推荐使用瓶装的色谱级纯水,特别是在系统刚开启时。如果使用水净化系统得到的水,要确保此水净化系统经过了活性碳清除了有机物,并且活性碳柱芯必须安装在离子交换柱芯的后面。(许多离子交换树脂没有去除对OPA 有影响的污染物而产生不可接受的荧光背景。)

试剂瓶中的液体必须每隔3 到4 天更换一次以防止细菌的生长。
测试混合物只能作为氨基甲酸酯的定性测定,不推荐将其作为校正使用。
所有样品必须通过0.45μm 薄膜过滤。如果存在胶体,则需进一步过滤。
水性样品溶解于适合的缓冲溶液,具体细节参见EPA 531.2.
甲醇溶解样品,进样10μl。近样量大降引起峰的变形。
小体积水样进样(<20μl),两种分析柱均可以使用。当进样体积大于300μl,则只能使用25cm 的分析柱,并使样品停留在泵头一段时间。
不要使用乙晴灌冲系统,因为其可能会使反应器中产生硅盐沉淀。如果使用乙晴作为流动相,乙晴的浓度不要超过70%。
不要用水保存色谱柱。

参考文献
[1]NY/T 761-2008 蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定

草苷膦

草苷膦和其代谢物AMPA 的测定,达到并超过环境保护署(EPA)547 方法要求的准确度与灵敏度。

草苷膦是一种广谱除草剂。它广泛用于农业,所以存在于饮用水中。一种灵敏的分析方法被开发用来分析草苷膦和其基本代谢物甲氨磷酸的水平。

恒信的柱后衍生方法也可以对植物和土壤中的草苷膦和甲氨磷酸进行测定。利用简单的提取过程,然后利用阳离子交换柱芯进行清除,改进了蔬菜样品的制备过程。

背景
草苷膦和甲氨磷酸被强离子交换柱分离。(完全磺酸化,交联的聚苯乙烯,K+/H+混合模式)。等度分离之后,分析柱被KOH 溶液再生,然后用洗脱液进行再平衡。

通过两步柱后衍生反应实现荧光检测。步,将草苷膦被次氯酸盐氧化为氨基乙酸。第二步,氨基乙酸与邻苯二醛和ThiofluorTM(一种pH9-10 的硫醇)产生高荧光的异吲哚。AMPA 不需要步的氧化过程便可与OPA 试剂反应(如图); 过氧化会使它产生的荧光减弱。

基本的样品配制
下面是蔬菜和水样品中含有的草苷膦的基本样品制备过程。蔬菜的测定方法与AOAC 的测定过程不同。我们开发了离子交换柱芯,省略了许多繁琐的提取过程,提高了提取的重复性。该柱芯经过本实验室可靠的认证。

蔬菜样品分析

提取:
取去除水分的25g 匀质样品,加水至125ml。高速搅拌3-5 分钟,然后离心10 分钟。将20ml 水性提取液转移至离心管中,加15ml 亚甲基氯以形成非极性共聚物,振摇2-3 分钟,离心10 分钟。转移4.5mL 上清液至离心管中,加入0.50mL 酸性改性剂(16g KH2PO4,160mL H2O,40mL 甲醇,13.4mLHCl),振摇后离心10 分钟。

根据基质调整方法:蔬菜含大量1)水2)蛋白质3)脂肪

1) 因为玉米中含有大量的水,将检测样品量降至12.5g
2) 含有大量蛋白质时加入100μL HCl 至20mL 的粗提物中,振摇离心10min。
3) 脂肪含量高的玉米,进行两次二甲基氯提取。

阳离子交换提取:转移1mL 前提取物(含0.18g 玉米或0.09 干燥过的玉米)至交换柱中。用0.7mL 洗提液(160mL H2O,2.7mL HCl,40mL 甲醇)洗脱,弃去洗脱液,重复两次。然后用12mL 洗提液用圆底烧瓶收集。使用旋转蒸发仪至水浴中恒温40℃蒸发至干燥,或收集于离心管中使用真空旋转蒸发仪。用2.0mL洗提液溶解滤渣(1.5mL 对干躁的玉米)。提取物在蒸发前可在冰箱中保存7 天。

水样分析
用0.45μm 的滤膜过滤,进样200-400μL
如果草苷膦出现分叉峰,在样品瓶中直接滴2 滴Restore 溶液。

试剂制备
注意:5%次氯酸钠用来制备氧化试剂

将945mL 次氯酸稀释液直接倒入试剂瓶中,贴上氧化试剂标签。加100μL 5%次氯酸钠于稀释液中。根据调整加入的氧化试NaOCl 的体积,得到首张色谱图后,调整草苷膦和甲氨磷AMPA 的相对峰面积大小。右图显示了两者之间的关系。

盖上试剂瓶盖,关闭通风阀,完全的振摇混合完全。

注意:不是使用次氯酸钙作为氧化试剂。它会造成柱后反应器的堵塞。一年的质保不包括由次氯酸钙造成的损坏。EPA 草案547 的方法关于这一点是错误的。Ca3PO4 不溶于水。
OPA 试剂

1 将945mL OPA 稀释液(104)倒入试剂瓶,留下大概5mL 进行第五步。
2 盖上瓶盖,打开通风阀,打开气源。使惰性气体喷射满全瓶。持续冒泡10 分钟
3 将100mgOPA(Cat No O120)溶解于10mL 色谱纯甲醇中。
4 关闭气源,打开瓶盖。将OPA 溶液倒入已经去氧的稀释液中。
5 溶解2g ThiofluorTM(Cat No 3700-2000)与步留下的5mLOPA 稀释液中并倒入试剂瓶。
6 盖上瓶盖,打开气源,使其喷射几分钟后关闭进气阀。轻轻摇动试剂瓶使其完全混匀。

注意:不推荐自行配制OPA 稀释液,因为硅酸钠包含许多重金属离子和不溶物质。它们将会沉淀在反应器和流通池中。一年的质保不包括此种污染带来的损坏。

OPA 试剂对氧敏感并会降解。当OPA 试剂瓶中充满惰性气体时,OPA 试剂的活性和保持2 周。

柱后衍生条件

草苷膦分析使用1954150 分析柱和1953020 保护柱

柱温:55℃ HPLC 流速:0.4mL/min

HPLC 程序

准确的再平衡时间取决于HPLC 的内体积。当基线和柱压平稳2 分钟,则色谱柱已充分平衡。
柱后条件:
试剂1:100μL 5%NaOCl 于GA116 稀释液中
试剂2:邻苯二醛和ThiofluorTM 于GA104 稀释液中
泵1:流速0.30mL/min
泵2:流速0.30mL/min
反应器1 体积:500μL
反应器2 体积:100μL
反应器1 温度:36℃
反应器2 温度:室温

分析过程
在设定后使色谱柱平衡20 分钟

注射10μL 草苷膦测试混合液(或者一定体积的自制标准品),收集张谱图。下图是一张标准的草苷膦和AMPA 色谱图,其中草苷膦和AMPA 浓度相同,峰高应该相同。但峰高受次氯酸盐试剂1 的影响。

样品色谱图

草苷膦测试混合物,10μL 进样

草苷膦和AMP, 13Pppb 于K200, 100μL 进样

椰菜样品中含有的草苷膦和AMPA,50ppb,100μL 进样。

完成分析之后,执行关闭程序,将分析柱保存于RG019 中。

注意:保存OPA 试剂是应保留惰性气体,关闭试剂瓶上蓝色的试剂阀防止不使用时试剂虹吸。

注意事项

配制试剂过程中要始终配带手套,OPA 与ThiofluorTM 试剂会引起皮肤刺激。OPA 试剂为对氧敏感,不断降解。得到佳的灵敏度需新制溶液。在惰性气体的保护下,OPA 试剂可以保存两周。ThiofluorTM 具有强烈的吸湿性,一定要在密封性好的容器中保存。

不推荐用户自制OPA 稀释剂,因为硼酸钠(任何等级)包含着大量的重金属离子污染物和不溶物质。这些不纯物会沉淀在反应器和流通池中。由此造成的损坏不在保修范围之中。

通常只会污染保护柱,只更换保护柱,将省去去清洗与再平衡。

需要特别注意的污染物:铁离子、多价的阳离子、有机染料、表面活性剂、清洁剂和油脂。它们会引起不可逆的损坏。

有机溶剂会引起色谱柱中的树脂膨胀,产生高背压和峰展宽。色谱柱有时可被再生。
将Pickering 洗脱液与色谱柱一起使用。
测试混合物只能作为草苷膦的定性测定,不推荐将其作为校正使用。

所有样品必须通过0.45μm 薄膜过滤。如果存在胶体,则需进一步过滤。

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